Protein A/G COIP & CHIP 磁珠

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产品描述

BEENbio Protein A/G Co-IP & CHIP磁珠在大小为2um的纳米磁珠上供价结合了大量的Protein A/G蛋白，与传统的Protein A/G 免疫共沉淀琼脂糖凝胶比较，抗体结合能力相同，背景更低的特点，由于采用磁性分离，使得每次Co-IP 和 CHIP可以节省40%的时间。

产品特性

储存条件

pH 6-8, 4^oC长期稳定，禁止产品冻结。

使用说明

磁珠@抗体复合物的制备

磁珠预处理：对于6cm细胞培养皿培养的细胞，建议磁珠用量为20uL, 取出磁珠产品，充分混匀后，吸取20uL至1mL PBST中，平衡2min, 磁力架分离磁珠，1mL PBST 再洗1次，磁力架分离磁珠。

平衡好的磁珠中加入500uL PBST，再加入10 uL抗体，常温下孵育1h，或者4℃孵育2-4h。

磁力架分离磁珠，弃上清，500uL PBST洗涤2次，每次2min。最后400 uL PBST放置4℃备用。

细胞抗原样品制备

对于贴壁细胞，移去培养基，对于6cm细胞培养皿培养的细胞， 加入适当体积的胰酶消化，1500rpm离心收集细胞， 500 uL PBS轻轻的洗涤1次，弃上清，然后加入400uL RIPA细胞裂解液，相应体积的蛋白酶抑制剂，4℃裂解细胞20min, 4℃ 12000rpm 离心10min收集上清液， 置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

磁珠@抗体复合物与细胞裂解液抗体结合

磁力架分离制备好的磁珠@抗体复合物，弃上清，加入400uL 抗原细胞裂解液，4℃孵育2-4h(如果时间紧张，也可以在室温下孵育30-60min)，随后磁力架分离磁珠，上清留样后续检测，磁珠加入1mL PBST, 洗涤 5min, 共3-4次。

磁力架分离磁珠，弃上清，

洗脱

3.3.1 变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE检测。分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入50 µL 1× SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，95℃加热5min。分离磁珠，收集上清，进行SDS-PAGE检测。

3.3.2 非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入50 µL洗脱缓冲液（Elution buffer: 0.1 M -0.2 M Glycine, 0.1%-0.5% Triton 100 or Tween 20, pH 2.5-3.1。），室温孵育10min；分离磁珠，收集上清液至新的EP管，并立即加入5 µL 中和缓冲液（1M tris-Hcl，pH 8.0）将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。

抗原样品制备

请根据不同的样品选择合适的处理方法：

磁珠预处理：

将磁珠充分混悬，取25~50 µL 磁珠，400 µL结合缓冲液洗涤3次，弃上清。

抗体与磁珠结合：

抗体稀释：结合缓冲液稀释抗体至终浓度为 5~50 µg/mL，置于冰上备用。

抗体结合：将准备好的400 µL抗体加入准备好的磁珠中，置于翻转混合仪孵育（常温30min, 4oC 2h），后进行磁性分离，收集上清液置于冰上以备后续检测。

洗涤（washing）：400 µL结合缓冲液洗涤4次，每次5min。

*注意：结合过程中，磁珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象 ，不会影响实验结果。）

抗原与抗体@磁珠复合物结合

加入400 µL步骤1准备的抗原样品，置于翻转混合仪（常温30min, 4oC 2h）。

洗涤（washing）：400 µL结合缓冲液洗涤4次，每次5min。

洗脱（Elution）：本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的 需要选择不同的抗原洗脱方法。

变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE检测。分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入25-50 µL 1× SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，95℃加热5min。分离磁珠，收集上清，进行SDS-PAGE检测。

非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入25-50 µL洗脱缓冲液，室温孵育 10min；分离磁珠，收集上清液至新的EP管，并立即加入1 µL 中和缓冲液将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。

常见问题及对策

1：如何提高抗体与磁珠结合效率?

磁珠与抗体的结合效率与抗体的种属来源及所属亚型有关，请确 认抗体的类型与 Protein A/G 配基的亲和效率。如抗体所属亚型与 Protein A/G的亲和度较低，可以通过增加抗体与磁珠的孵育时间（ 30～120min）、提高结合缓冲液的pH值（8～9）及降低离子强度（ 25～100mM NaCl）等方法提高亲和效率。

2：如何提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性?

可以先将抗体与样品进行孵育，形成抗体-抗原复合物，再用 Protein A/G磁珠捕获复合物。这种方法可以提高抗体与抗原的结合效 率，并降低磁珠与样品接触的时间，从而提高沉淀产物的特异性。对 于蛋白质/核酸共沉淀或染色质免疫共沉淀也推荐使用此法。

3： 如何避免磁珠在储存或使用过程中可能出现的聚集情况？

磁珠应保存在2～8℃，使用时应避免由于污染而导致的不可逆聚 集，或因干燥而导致的聚集。磁珠在低pH的洗脱缓冲液中发生聚集属 于正常现象，不影响磁珠的正常使用。在Binding buffer和Elution buffer中添加终浓度为0.1%(v/v)的非离子型去垢剂（如NP-40、 Tween-20 或 Triton X-100）可有效防止磁珠聚集。经过低pH洗脱操 作的磁珠可以用结合缓冲液洗涤至中性，然后用含有0.1% (v/v)Tween-20的Tris buffer(pH7.5)振荡重悬磁珠，并用超声波水浴 处理2min，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体 结合效率。

4： 如何解决磁珠易粘附管壁的现象？

建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外，在缓冲液中添加 0.01%～0.1%(v/v)的非离子型去垢剂（如NP-40、Tween-20或 Triton X-100）可以有效降低磁珠对耗材的粘附。

5： 磁珠在使用过程中出现结块现象？

磁珠在使用时如果出现结块现象一般较难振荡打散，容易导致分 布不均，出现该问题的原因是磁珠在磁场中放置太久而使磁珠牢固的 结合在一起。用超声波水浴处理 2min 即可打散磁珠使其重新分散， 但应注意超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落，所以磁珠在加样后洗脱前不宜使用该方法。

缓冲液汇总

Co-IP & CHIP磁珠缓冲液汇总：

细胞裂解液：正常RIPA 细胞裂解缓冲液(一般是公司购买)

抗体磁珠结合buffer：PBST(1*PBS + 1% Triton X-100)

Washing buffer: PBST(1*PBS + 1% Triton X-100)

抗原与抗体/磁珠复合物binding buffer：可以用RIPA 细胞裂解缓冲液代替

Washing buffer: PBST(1*PBS + 1% Triton X-100)

6、Elution buffer: (1)变性洗脱缓冲液，直接加入1*蛋白loading buffer, 98^oC 5 min后弃去磁珠后，收集上清液检测。（2）非变性洗脱缓冲液：Elution buffer: 0.1 M -0.2 M Glycine, 0.1%-0.5% Triton 100 or Tween 20, pH 2.5-3.1。